1599-1600
San Luigi dei Francesi, Cappella Contarelli, Roma
Olio su tela, 332 x 340 cm

Il dipinto fa parte della decorazione della cappella che Mathieu Cointrel, poi il cardinale Contarelli, acquistò nel 1565 nella Chiesa di San Luigi dei Francesi. Alla sua morte, avvenuta due decenni più tardi, aveva lasciato al suo esecutore testamentario tutte le istruzioni per la decorazione della cappella. In un primo tempo la commissione della decorazione fu affidata al Cavalier D’ Arpino, che eseguì esclusivamente gli affreschi  della volta. Poi, nel 1599, passò a Caravaggio, probabilmente grazie all’intervento del suo protettore, il cardinal del Monte.
Contarelli aveva descritto dettagliatamente quello che voleva: “ San Matteo dentro un […] salone ad uso di gabella con diverse robbe che convengono a tal ufficio con un banco come usano i gabellieri con  libri et denari […]. Da quel banco San Matteo, vestito secondo che parerà convenirsi a quell’arte, si levi con il desiderio per venire a Nostro Signore che passando lungo la strada con i suoi discepoli lo chiama. “
Nell’affrontare la prima committenza pubblica, Caravaggio doveva risolvere almeno due problemi: raffigurare due ambienti fisici diversi, la “strada” ed il “salone”, e creare una composizione narrativa in cui più personaggi raffigurassero un’azione.  Caravaggio li risolve entrambi costruendo la scena intorno al gesto di Cristo che indica Matteo, la cui importanza è posta in risalto rispetto ai personaggi che lo circondano. 
L’opera è la prima grande tela nella quale Caravaggio, per accentuare la tensione drammatica dell'immagine e focalizzare sul gruppo dei protagonisti l'attenzione di chi guarda, ricorre all'espediente di immergere la scena in una fitta penombra tagliata da squarci di luce bianca, che fa emergere visi, mani o parti dell'abbigliamento e rende quasi invisibile tutto il resto.
La tela, inoltre, è densa di significati allegorici. In primo luogo proprio la luce, grande protagonista della raffigurazione pittorica, assurge a simbolo della Grazia divina (non a caso non proviene dalla finestra dipinta in alto a destra che, anzi, resta del tutto priva di luminosità, ma dalle spalle di Cristo), Grazia che investe tutti gli uomini pur lasciandoli liberi di aderire o meno al Mistero della Rivelazione; non bisogna dimenticare, poi, che la chiesa di S. Luigi rappresentava la nazione francese, e l'allora Re di Francia, Enrico IV, s'era appena convertito al Cattolicesimo, scegliendo così la Salvezza. E così, solo alcuni dei personaggi investiti dalla luce (i destinatari della "vocazione" insieme a Matteo il Pubblicano) volgono lo sguardo verso Gesù, mentre gli altri preferiscono restare a capo chino, distratti dalle proprie solite occupazioni. Non è forse casuale che uno dei compagni di Matteo porti gli occhiali, quasi che fosse accecato dal denaro. Il fatto, poi, che essi siano vestiti alla moda dell'epoca del Pittore ed abbiano il viso di modelli scelti tra la gente comune e raffigurati senza alcuna idealizzazione, con il realismo esasperato che ha sempre caratterizzato l'opera di Caravaggio, trasmette la percezione dell'artista dell'attualità della scena, la sua intima partecipazione all'evento raffigurato, mentre su un piano altro, totalmente metastorico, si pongono giustamente il Cristo e lo stesso Pietro, avvolti in una tunica senza tempo. Tale partecipazione viene espressa in modo ancor più efficace, se possibile, nell'altra tela di grandi dimensioni, raffigurante il Martirio del Santo, nella quale da una colonna sulla sinistra sbuca timido e pregno di compassione, volto che non è altro se non l'autoritratto di Caravaggio stesso, che pare riaffermare la propria personale partecipazione all'evento narrato.
Di grande intensità e valenza simbolica, nella Vocazione, è il dialogo dei gesti che si svolge tra Cristo, Pietro e Matteo. Il gesto di Cristo (che altro non è che l'immagine speculare della mano protesa nella famosissima scena della Creazione di Adamo – Cristo è il "nuovo Adamo" – della Cappella Sistina michelangiolesca, che Caravaggio avrà certo avuto modo di studiare ed apprezzare) viene ripetuto da Pietro, simbolo della Chiesa Cattolica Romana che media tra il mondo divino e quello umano (siamo in periodo di Controriforma) ed a sua volta ripetuto da Matteo. È la rappresentazione simbolica della Salvezza, che passa attraverso la ripetizione dei gesti istituiti da Cristo (i sacramenti) e ribaditi, nel tempo, dalla Chiesa.
Grazie alla radiografia, siamo venuti a conoscenza che nella prima versione non era presente la figura di San Pietro, aggiunta successivamente.
Questa è una delle prime pitture sacre, esposte al pubblico, in cui compaiono notazioni realistiche.